Universal SYBR Green qPCR Mix

儲運條件

長期保存請于-20℃避光保存，Mix 融解后可在4℃避光條件下穩定存放一個月，盡量避免反復凍融。

產品組分

Universal SYBR Green qPCR Mix 

產品簡介

Universal SYBR Green qPCR Mix 是SYBR® Green I 嵌合染料法專用qPCR 試劑，為2× 預混液，包含除引物和DNA 樣品以外的所有qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是經抗體修飾的熱啟動Taq DNA 聚合酶，配合精心優化的Buffer 體系以及PCR 反應促進因子，使產品具有特異性強、擴增效率高等特點，有效抑制非特異性擴增，可對寬廣濃度范圍的模板進行準確定量，獲得穩定可靠的qPCR 結果。預混液中含有通用校正染料，與絕大多數 qPCR 設備兼容，包括需要 ROX 校正的儀器，實驗過程中一般不需要額外添加校正染料。

使用方法

1. 使用注意

① 因Mix 中預混有染料，其保存或反應體系配制過程應避免強光照射；

② 使用前上下顛倒輕輕混勻Mix，請勿渦旋振蕩混勻，避免產生過多氣泡;

③ Mix 中含有Universal 校正染料，適用于所有機型，無需額外添加染料。

2. 建議的qPCR 反應體系

a. 通常推薦的引物終濃度為0.2 μM，反應效果不佳時可在0.1~1 μM 范圍內進行調整；

b. 推薦模板加樣量為1~2 μl，如模板類型為未稀釋cDNA 原液，模板添加量不應超過總反應體系的10%。不同種類DNA 模板中含有的靶基因拷貝數目不同，必要時可進行梯度稀釋，以確定最佳的DNA 模板添加量。

3. qPCR 反應程序（可根據機型適當調整）Universal SYBR Green qPCR Mix

兩步法

三步法

a. 根據引物的Tm 值進行退火& 延伸（退火）溫度的設定；若擴增片段在200bp 以內，退火& 延伸（延伸）時間可以設置為15 sec；此外，退火& 延伸（延伸）時間的設置還需根據您使用的qPCR 儀所需要的最短數據采集時間自行調整；

b. 不同qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別，一般可使用儀器默認的熔解曲線采集程序。

4. 實驗優化

若使用默認反應條件反應性能不佳時，則需要進行反應條件的優化，可以從引物濃度以及擴增程序兩個方面進行：

① 引物濃度調整

當引物終濃度在0.1~1.0 μM 范圍之間變化時，引物濃度越低，擴增特異性越高，但擴增效率會有所下降。

② 擴增程序優化

需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。

5. 引物設計原則

① 擴增產物長度建議控制在80~200 bp；

② 引物長度為18~25 bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm 值相差不超過1℃為佳，Tm 值控制在58~62℃為佳；

④ 引物的GC 含量控制在40%~60% 之間；

⑤ 引物A、G、C、T 整體分布盡量要均勻，避開T/C 或者A/G 的連續結構（特別是3' 端）；

⑥ 引物3' 端最后一個堿基最好為G 或者C；

⑦ 避開引物內部或者兩條引物之間的互補序列；

⑧ 使用NCBI BLAST 功能檢索確認引物的特異性。

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