一、細胞培養及轉染

一、實驗方法

1. 培養293T細胞，待細胞長滿后調整細胞濃度為1×105cells/ml，接種于24孔培養板，每孔500uL，37℃，5%CO2培養箱內培養24h，觀察細胞80%粘連。

 2. 制備轉染復合物

A) 用100μl無血清培養基稀釋3’UTR雙熒光素酶報告基因載體，輕輕混勻；

B) 用100μl無血清培養基稀釋RBP過表達載體，輕輕混勻；

C) Lipofectamine 2000使用前，輕輕混勻，用100μl無血清培養基稀釋2.5μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫孵育5min；

D) 將A、 B、C的液體加在一起，輕輕混勻，室溫孵育20min，轉染復合物形成。

3. 將24孔板中200μl 培養基，再分別加入300uL上述混合液，每孔終體積為500uL。質粒濃度均為500ng/孔，每組設置3個復孔。

5. 37 ℃，5%CO2培養箱內培養4-6h后，吸掉上清液，加入500uL的*培養基，于培養箱內培養48h后備用。

二、雙熒光報告基因檢測

2.1 實驗材料

 雙熒光檢測試劑盒(promega E1910)

脫色搖床(海門市其林貝爾TS200A)，低溫冷凍離心機 (Sigma 3K15)，發光檢測儀 (Molecular Devices SpectraMax®i3 )。

2.2 實驗方法

具體實驗步驟參見試劑盒說明書

裂解細胞 ：吸盡細胞培養液后， PBS輕柔漂洗兩次，參考下表加入適量的1×PLB裂解液(用去離子水將5×Passive Lysis Buffer母液稀釋成1×PLB，可在4℃保存1個月)，室溫搖床放置15min充分裂解后備用。

注：細胞裂解后可以立即測定，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進行測定。

水浴溶解Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶液后，加入到1劑量的Luciferase Assay Substrate凍干粉中，充分溶解后分裝成若干小管，儲存在-20℃(≦1個月)或-70℃(≦1年)，使用前水浴解凍，上下顛倒兩次并恢復至室溫備用

按照每個樣本100uL用量，取適量50×Stop & Glo®Reagent，用Stop & Glo®Buffer稀釋成1×Stop & Glo®Reagent，現配現用。

按儀器操作說明書開啟化學發光儀或具有檢測化學發光功能的多功能酶標儀，將測定間隔設為2秒，測定時間設為10秒。

每個樣品測定時，取樣品20uL，加入100uL LARⅡ試劑，用槍打勻后測定RLU1(relative light unit)。

加入100uL1×Stop & Glo®Reagent，用槍打勻后測定RLU2(relative light unit)。

2.3實驗結果分析